Yersinia enterocolitica впливає на кишкову бар’єрну функцію в товстій кишці

Ніна А. Герінг, Аня Фромм, Джудіт Кіхней, Ін-Фах М. Лі, Аннет Мотер, Йорг Д. Шульцке, Роланд Бюккер, Yersinia enterocolitica впливає на кишкову бар'єрну функцію товстої кишки, Журнал інфекційних хвороб, том 213, випуск 7, 1 квітня 2016 року, сторінки 1157–1162, https://doi.org/10.1093/infdis/jiv571

enterocolitica

Анотація

Інфекція Yersinia enterocolitica викликає гостру діарею в ранньому дитинстві. Модель зараження мишами представляє нові дані щодо патологічних механізмів у товстій кишці. Симптоми включають діарею з водянистими випорожненнями та втрату ваги, які мають свої функціональні кореляти у зниженні електричного опору трансепітелію та підвищеній проникності флуоресцеїну. Y. enterocolitica був присутній у слизовій оболонці миші обох кишок і товстої кишки. Тут бактеріальне озброєння мало фокальний характер і призвело до змін у експресії та архітектурі білків із щільним з'єднанням. Ці висновки відповідають спостереженням колишніх досліджень культури клітин і свідчать про механізм потоку витоків діареї.

Відомо, що Yersinia enterocolitica спричиняє гострий ентерит та ентероколіт, мезентеріальний лімфаденіт або ілеїт у людей (ієрсиніоз). Хоча в більшості випадків діарея, спричинена Y. enterocolitica, самообмежується і проходить протягом декількох днів, може виникнути ряд різних позакишкових наслідків або септицемії. Важкі системні інфекції вимагають антибіотикотерапії.

Ієрсиніоз є поширеною зоонозною хворобою, що передається через їжу. Фактори ризику придбання бактерій для немовлят та маленьких дітей, на яких частіше страждають, ніж дорослі, були визначені як гра в пісочниці [1] або контакт з домашніми тваринами [2]. У Німеччині ця інфекція, що підлягає повідомленню, сталася у 2010 р. Із 4 випадками на 100 000 населення та 48 випадками/100 000 дітей [1]. Однак інфекція Y. enterocolitica поширюється у всьому світі з різною поширеністю, що залежить від штаму.

Наразі патологічні механізми Y. enterocolitica в основному призначалися ексудативній діареї з негерметичної клубової кишки, де бактерії можуть індукувати абсцеси з субэпітелію. Однак ефекти на товсту кишку недооцінені, і передбачувані зміни TJ не розглядались. У цьому дослідженні ми мали на меті підтвердити наші висновки щодо вогнищевих збурень TJ, що спостерігаються на моношарах клітин товстої кишки, інфікованих Yersinia.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ

Процедура зараження

Самки мишей C57BL/6 у віці 6–8 тижнів (середня вага [± SEM], 17,7 ± 0,2 г; лабораторії Джексона, Бар-Харбор, штат Мен) утримувались у специфічно вільних від мікробів умовах (тобто утримання без специфічних патогенів), а експерименти проводились згідно з рекомендаціями щодо експериментів на тваринах. Мишей заражали перорально 6 × 10 7 Y. enterocolitica (WA-314 pYVO8 +) [9]. Етичне схвалення було отримано від місцевого комітету з питань етики з експериментів на тваринах (Landesamt für Gesundheit und Soziales, Берлін, Німеччина; номер затвердження G0732/08). Вагу тіла вимірювали щодня, а зразки калу збирали, гомогенізували у забуференному фосфатом сольовому розчині (PBS) та висівали в різних розведеннях на селективний агар Yersinia (Sigma-Aldrich, Schnelldorf, Німеччина). Тварин евтаназували через 2 або 5 днів після зараження. Видаляли клубову кишку і товсту кишку, вимірювали їх довжину. Зразки збирали безпосередньо для електрофізіологічних вимірювань, заморожували для екстракції білка або фіксували у 2% параформальдегіді або формаліні для мікроскопічного аналізу.

Використовуючи експерименти

Зразки тканин встановлювали в камери Уссінга. Спектроскопію однопроменевого імпедансу та односпрямовані вимірювання потоку 0,1 мМ флуоресцеїну (332 Да) або 0,3 мМ флуоресцеїну ізотіоціанату (FITC) -декстран-4000 (4 кДа; Sigma-Aldrich) проводили, як описано раніше [10].

Флуоресценція in situ гібридизація (FISH)

Зразки тканин фіксували у 3,7% (об/об) формальдегіду в PBS (pH 7,4), що містить 50% (об/об) етанолу при 4 ° C. Вбудовування зразків з використанням холодної полімеризуючої смоли та FISH проводили, як описано раніше [11]. Експерименти FISH проводили з використанням панбактеріального зонда EUB338 (biomers.net; Ульм, Німеччина), який зв'язується з частиною компонента 16S рибосомної РНК (рРНК) та безглуздим зондом NON338, щоб виключити неспецифічне зв'язування зонда. Для конкретної візуалізації Y. enterocolitica ми використали зонд FISH Y.16S-69, спрямований на 16Р рНК, 5-TAAACTACTTCCCGCTGC-3 ′ [12]. Слайди візуалізували за допомогою конфокальної лазерно-скануючої мікроскопії.

Фарбування гематоксилін-еозином (ВІН)

Зразки фіксували у 4% забуференному формаліні та вкладали у парафіновий віск. Фарбування ВІН проводили на серійних зрізах (товщина, 3 мкм).

Імунофлуоресцентне фарбування

Імунофлуоресцентне фарбування та подальшу лазерну скануючу мікроскопію проводили, як описано раніше [10]. Були використані такі антитіла: анти-ZO-1, антиокклюдин, анти-клаудин-5, анти-клаудин-8 (1: 100), Alexa Fluor 488 козячий анти-мишачий або кролячий IgG та Alexa Fluor 594 козячий антитіла -IgG миші або кролика (1: 500; Invitrogen, Карлсруе, Німеччина). Ядра фарбували DAPI (1: 1000).

Вестерн-блотинг

Зразки тканин гомогенізували шляхом промивання в буфері для лізису (1 мМ Tris-Cl [рН 7,4], 1 М MgCl2, 0,5 мМ етилендіамінтетраоцтової кислоти, 0,5 М етиленгліколю тетраоцтової кислоти та коктейлю інгібітора протеази; Рош, Мангейм, Німеччина). Вестерн-блот проводили, як описано раніше [6].

Забарвлення апоптозу

Тканини фіксували 4% формаліном, вкладали у парафін і розрізали на поперечні перерізи 1 мкм. Після депарафінізації та демакінгування зрізи тканин фарбували за допомогою термінального дезоксинуклеотидилтрансферази, опосередкованого дезоксиуридин трифосфатом, міткою (In-situ Cell Death Detection Kit-Fluorescein, Roche), як описано раніше [6].

Статистика

Дані виражаються як середні значення ± стандартна похибка середнього значення. Статистичний аналіз проводили за допомогою 2-хвостового тесту Стьюдента. P ≤ .05 вважали статистично значущим.

РЕЗУЛЬТАТИ

Зміни в архітектурі слизової та виявлення Yersinia enterocolitica у дистальній кишці миші через 2 дні після зараження. A, фарбування гематоксиліном-еозином виявило, що довжина крипт буде фокально збільшена в інфікованих моношарах (стрілки). B, Кількісне визначення довжини крипти (P 2 проти 87 ± 10 Ом см 2 у контролях; P 2A). Це супроводжувалося 2,5-кратним збільшенням проникності для флуоресцеїну (середнє значення [± SEM], 0,52 × 10 −6 ± 0,13 × 10 −6 проти 0,18 × 10 −6 ± 0,06 × 10 −6 см/секунду в контролях; P −6 ± 0,05 × 10 −6 проти 0,11 × 10 −6 ± 0,04 × 10 −6 см/секунду в контролях; P = .07; n = 12). Вимірювання на зразках клубової кишки під час цієї серії експериментів з інфекцією підтвердило зменшення ТЕР, про яке повідомляли раніше Гогартен та ін. [4] (дані не наведені).

Порушення бар’єру та щільні з’єднання (TJ) через 2 дні після зараження. A, Вклад епітеліальної резистентності (R епі) та субепітеліальної резистентності (R sub) до загальної трансепітеліальної резистентності (R t) вимірювали за допомогою 1-контурної імпедансної спектроскопії в дистальній частині товстої кишки миші. Інфекція призвела до зменшення R епі та R суб, порівняно з контролем (n = 12). B і C, репрезентативні вестерн-плями (B) та денситометрична кількісна оцінка (C) Yersinia enterocolitica-інфікованої товстої кишки та клубової кишки (n = 10–12; * P епі) та субепітеліальна резистентність (R sub) до загальної трансепітеліальної резистентності (R t ) вимірювали за допомогою 1-контурної імпедансної спектроскопії в дистальному відділі товстої кишки миші. Інфекція призвела до зменшення R епі та R суб, порівняно з контролем (n = 12). B і C, репрезентативні вестерн-блоти (B) та денситометрична кількісна оцінка (C) Yersinia enterocolitica-інфікованої товстої кишки та клубової кишки (n = 10–12; * P Рисунок 2B та 2C). Імунофлуоресцентне фарбування білків TJ та подальші аналізи за допомогою конфокальної лазерної скануючої мікроскопії виявили регіональне зменшення або перерозподіл клаудіну-5 та оклюдину. При більшому збільшенні крипти в місцях інфікованої слизової ободової кишки демонстрували дифузні сигнали білка TJ, дислоковані з TJ у внутрішньоклітинні компартменти (рис. 2D). Архітектура або розподіл claudin-8 не була змінена.

ОБГОВОРЕННЯ

Окрім зараження видами Campylobacter або Salmonella, Y. enterocolitica є частою причиною харчової бактеріальної діареї та гастроентериту, особливо у дітей молодшого віку. Однак механізми діареї, спричиненої Y. enterocolitica, все ще недостатньо вивчені.

Такі процеси, як активна секреція аніонів або залежна від натрію мальабсорбція транспортера глюкози внаслідок інфекції Y. enterocolitica, були виключені в клубовій кишці миші [4]. Autenrieth та Firsching спостерігали утворення абсцесів у брижових лімфатичних вузлах [3], що могло сприяти витіканню. Нещодавно ми виявили, що Y. enterocolitica порушує епітеліальну бар'єрну функцію, впливаючи на структуру TJ та експресію білка на моделі інфекції в епітеліальних клітинах товстої кишки. Тому в нашому цьому дослідженні ми розглянули питання про те, чи діарея, викликана Y. enterocolitica, у моделі миші пов’язана із змінами TJ. Крім того, набагато менше відомо про відповідь на Y. enterocolitica в товстій кишці порівняно з клубовою кишкою. Однак товста кишка є важливим сегментом для всмоктування води уздовж шлунково-кишкового тракту.

У цьому дослідженні ми демонструємо, що Y. enterocolitica можна виявити як окремі організми, так і в мікроколоніях на слизовій оболонці товстої кишки за допомогою специфічного зонда FISH. Бактеріальну інвазію та транслокацію ієрсинії можна спостерігати в клубовій кишці та проксимальній та дистальній кишці інфікованих мишей. На тій же стадії інфекції індукована ієрсинією дисфункція бар’єру характеризувалася зниженням резистентності епітелію та збільшенням проникності флуоресцеїну. Епітеліальна резистентність за відсутності апоптозу епітелію в основному визначається цілісністю TJ. Відомо, що білки TJ клаудін-5 і клаудин-8, на які вплинула ієрсинія у цьому дослідженні, діють як сильні бар'єрні формоутворювачі [5]. Знижена експресія цих білків 2 TJ дійсно може бути причиною порушення епітеліального бар'єру. Цікаво, що зменшення експресії клаудіну-8 узгоджується з нашими висновками щодо епітеліальних моношарів, де Y. enterocolitica зменшила експресію клаудіну-8 через втручання в сигналізацію c-Jun [6].

Трицелюлін - це спеціалізована молекула TJ, яка обмежує проходження високомолекулярних та іонних речовин через центральну трубку триклітинного TJ, місця, де 3 клітини стикаються в епітелії [13]. Зменшення експресії трицелюліну у заражених тварин може пояснити тенденцію до збільшення проникності FITC-декстрану на 4 кДа. Крім того, окклюдин відіграє вирішальну роль для сигналізації TJ, і передбачається, що він ініціює положення трицелюліну в триклітинному TJ [5]. Отже, зменшення експресії оклюдину може також посилити проникність макромолекули.

Фарбування ВІН не виявляло проникнення імунних клітин у слизову. Тому здається малоймовірним, що ці зміни TJ вдруге обумовлені запальною реакцією, оскільки вона присутня при запальних захворюваннях кишечника [14].

У наших дослідженнях культури клітин на моношарах клітин товстої кишки ми показали, що Y. enterocolitica порушує епітеліальну бар'єрну функцію через регіональні, переривчасто розподілені зміни TJ [6]. У цьому дослідженні для більш детального вивчення використовували мікрофотографії FISH, і дані свідчать про те, що патогенна образа на слизову дійсно не впливала рівномірно. Крім того, фокусно збільшено довжину склепу. Ми не змогли виявити глобальних змін у субклітинних моделях розподілу TJ на мікрофотографіях імунофлуоресценції, але можна було виявити фокальне зменшення сигналів білка TJ, як це вже було видно з денситометрії Вестерн-блот. Частковий перерозподіл клаудину-5 та оклюдину з домену TJ ентероциту функціонально додав втрати бар'єру. Знову ж таки, це узгоджується з нашими висновками про моношари епітелію, де Y. enterocolitica також індукував регіональні зміни TJ [6].

З цього та попередніх досліджень ми дійшли висновку, що Y. enterocolitica має різні патомеханізми, і що інфекція охоплює не тільки тонку кишку, але і товсту кишку. Кілька досліджень продемонстрували, що Y. enterocolitica може інвазувати епітеліальний бар'єр клубової кишки через М-клітини, переноситись в ділянки Пейєра та уникати імунних клітин шляхом транслокації ефекторних молекул Yop [15]. Цей патомеханізм може мати значення для поширення бактерій на інші органи, що є необхідною умовою для постінфекційних проявів. Це дослідження доводить, що Y. enterocolitica також може вторгнутись на слизову оболонку товстої кишки, де це спричиняє значну бар'єрну дисфункцію, включаючи різкі зміни експресії білка TJ та архітектури. Як наслідок, розчинники та вода можуть витікати назад у просвіт кишечника, що призводить до обмеженої резорбційної здатності та менш концентрованого калу. Ми припускаємо, що діарея, спричинена Y. enterocolitica, виникає через механізм потоку витоків.

Примітки

Подяки. Ми дякуємо Детлефу Соргенфрею († січень 2015 р.) За чудову технічну допомогу.

Фінансова підтримка. Ця робота була підтримана Deutsche Forschungsgesellschaft (Schu 559/11).

Потенційні конфлікти інтересів. Усі автори: Конфліктів немає. Усі автори подали форму ICMJE для розкриття потенційних конфліктів інтересів. Розкрито конфлікти, які редактори вважають відповідними до змісту рукопису.