Противіковий ефект олігосахариду хітозану на підгостре старіння мишей, викликане d-галактозою
Анотація
1. Вступ
Хімічна структура COS.
На підставі попередніх досліджень біологічної активності COS, цілком обгрунтовано вважати, що цей олігосахарид може мати значний потенціал для використання в області проти старіння. Однак відомостей про захисну дію цього природного полісахариду з низькою молекулярною масою проти d -галактози (d -gal), викликаного підгострим старінням in vivo, обмежено. Отже, дане дослідження мало на меті дослідити антивікову активність COS шляхом внутрішньошлункового втручання у підгострого старіння мишей, викликаних d -gal, головним чином шляхом вимірювання параметрів окисного стресу, а також оцінки макроскопічного та гістопатологічного статусів мишей та/або їх основні органи, що забезпечують новаторську фармакологічну основу для антивікового ефекту COS.
2. Результати
2.1. Щоденне спостереження за поведінкою
Маса тіла мишей протягом періоду лікування.
2.2. Вплив COS на імунну функцію
Оскільки селезінка та тимус є видатними імунними органами, показники їх можуть відображати силу імунного статусу або поліпшення імунної функції [10]. Як показано в таблиці 1, після восьмитижневого лікування d -gal показники селезінки та тимусу мишей модельної групи були помітно нижчими, ніж показники нормальної групи, що вказує на те, що імунна система мишей гальмується введенням d -галь протягом 56 днів поспіль. Більше того, знижені показники селезінки та тимусу мишей, викликані лікуванням d -gal, поступово регулювались до певної міри після введення COS. Крім того, наші результати (як показано в таблиці 1) також показали, що сироваткові рівні імуноглобуліну G (IgG) та IgM помітно знижувались у мишей модельної групи порівняно з нормальними групами. Тим не менше, після того, як йому було проведено COS, рівні IgG та IgM були явно підвищені в залежності від дози.
Таблиця 1
Вплив COS на показники органів та імунну функцію у мишей, які отримували d -gal.
| Звичайний | 0,22 ± 0,05 | 0,58 ± 0,28 | 0,80 ± 0,03 | 0,16 ± 0,03 |
| Модель | 0,14 ± 0,05 # | 0,34 ± 0,09 # | 0,57 ± 0,04 # | 0,07 ± 0,02 # |
| VE | 0,19 ± 0,04 | 0,43 ± 0,16 | 0,61 ± 0,05 | 0,10 ± 0,03 |
| COS-L | 0,14 ± 0,04 | 0,42 ± 0,07 | 0,70 ± 0,04 * | 0,08 ± 0,02 |
| COS-M | 0,16 ± 0,06 | 0,49 ± 0,23 * | 0,72 ± 0,07 * | 0,11 ± 0,02 * |
| COS-H | 0,19 ± 0,05 | 0,53 ± 0,14 * | 0,77 ± 0,08 * | 0,12 ± 0,02 * |
Дані представляють середнє значення ± стандартне відхилення (SD) (n = 8). # Мишей, оброблених p d -gal, оцінювали шляхом вимірювання сироваткових рівнів аланінамінотрансферази (ALT), аспартаттрасамінази (AST) та лужної фосфатази (ALP). Як видно з таблиці 2, після лікування d -gal протягом восьми тижнів у мишей у модельній групі спостерігалося помітне підвищення рівня сироваткових рівнів ALT, AST та ALP у порівнянні з нормальними мишами (всі pd -gal викликані незвично високими рівнями ALT, AST та ALP у сироватках мишей поступово знижувались до певної міри у групах, які отримували VE та COS, порівняно з модельними мишами, особливо для групи COS-H, і ці рівні були помітно нижчими, ніж у моделі група (всі миші, оброблені pd-галом.
| Звичайний | 50,08 ± 5,46 | 20,88 ± 3,17 | 53,79 ± 4,40 | 51,46 ± 3,08 | 125,24 ± 9,52 |
| Модель | 82,26 ± 3,09 # | 28.20 ± 4.39 # | 78,51 ± 3,77 # | 61,49 ± 5,53 # | 162,55 ± 8,93 # |
| VE | 69,26 ± 6,05 * | 22,05 ± 4,02 * | 68,61 ± 5,24 * | 58,36 ± 6,28 | 142,83 ± 7,76 * |
| COS-L | 68,28 ± 4,57 * | 25,59 ± 3,63 | 65,15 ± 4,21 * | 55,51 ± 3,36 | 160,33 ± 5,55 |
| COS-M | 64,07 ± 3,29 * | 20,45 ± 2,05 * | 60,08 ± 2,26 * | 53,14 ± 3,70 * | 139,13 ± 11,03 * |
| COS-H | 58,85 ± 4,83 * | 19,10 ± 1,52 * | 57,01 ± 3,67 * | 51,99 ± 1,09 * | 130,39 ± 8,65 * |
Дані представляють середні значення ± SD (n = 8). # pd -gal-ін'єктованим мишам оцінювали шляхом вимірювання рівнів креатиніну (CREA) та сечової кислоти (UA) у їх сироватці крові, а результати також представлені в Таблиці 2, яка показує, що рівні CREA та UA в сироватці для моделі групових мишей значно вищі, ніж у звичайних мишей групи (всі pd -Гал-індуковані гістохімічні пошкодження печінки та нирок
Як показано на малюнку 3, нормальна гістологічна структура тканини печінки добре видно у мишей нормальної групи, включаючи всюдисущі полігональні гепатоцити, радіально діапазоновану печінкову канатик навколо центральної вени та незначну бінуклеацію гепатоцитів. Після восьмитижневого безперервного введення d -gal, тканина печінки виявила збільшену кількість бінуклеацій гепатоцитів, музово розташовану печінку, широко розповсюджену гепатоцелюлярну балонізацію та низку запальних клітинних інфільтрацій. Тим не менш, для групи, яка отримувала COS-H, в тканинах печінки мишей спостерігали менше запальних інфільтрацій та бінуклеації гепатоцитів, в той час як балонуючі гепатоцити зменшувались залежно від дози, вказуючи на те, що COS може поліпшити d - гал-індуковане пошкодження печінки певною мірою.
Гістопатологічний вигляд печінки (гематоксилін-еозин (ВІН) фарбування 400 ×). Бінуклеація гепатоцитів (чорна стрілка), печінковий канатик, розташований мусозно (жовта стрілка), і балонуючий гепатоцит (червона стрілка).
Крім того, гістопатологічний аналіз ниркової тканини мишей, оброблених d -gal, показав, що клубочок мав очевидну атрофію або навіть зник, а розширена балоном порожнина і крапля епітеліальних клітин у проксимальних ізвитих канальцях нирок, а також великий набряк нирок, може виникнути у порівнянні з нормальною групою (як показано на малюнку 4). Примітно, що лікування COS та VE суттєво послаблювало ці нездорові патологічні зміни ниркової тканини, спричинені d -gal, виявляючи захисну функцію нирок, тоді як нирковий набряк та розширена балонна порожнина значною мірою контролювались для групи COS-H. Ці результати показали, що COS успішно полегшив ці d -gal-індуковані патологічні пошкодження в тканинах печінки та нирок мишей Куньмін (миші KM).
Гістопатологічний вигляд нирки (фарбування ВІН 400 ×). Атрофія (жовта стрілка), крапля епітеліальних клітин у проксимальних звивистих канальцях нирок (чорна стрілка) та розширена балонна порожнина (червона стрілка).
2.5. Вплив COS на показники антиокиснення печінки та нирок
Попередні дослідження показали, що антиоксидантні ферменти можуть захищати печінку та нирки від підгострого старіння, викликаного d -gal, очищаючи АФК. Отже, діяльність SOD, CAT та GSH-Px, а також вміст малонового діальдегіду (MDA) були досліджені в нашому цьому дослідженні [5,6,7]. Як проілюстровано на малюнку 5, після підшкірного введення d -gal протягом восьми тижнів активність цих трьох ключових антиоксидантних ферментів різко знижувалася в порівнянні з діяльністю тканин печінки та нирок мишей нормальної групи, тоді як для MDA було навпаки рівень (усі pd -gal поступово підвищувались на ступінь вище, ніж у мишей модельної групи, а рівень MDA послаблювався COS залежно від дози (особливо у групі COS-H, мишей, оброблених pd -gal).
Вплив COS на діяльність SOD, GSH-Px та CAT, а також рівні MDA у печінці мишей (A) та нирок (), спричинені d -gal. Дані представляють середні значення ± SD (n = 8). # p d-група, оброблена галом; VE: d -gal плюс група лікування VE; COS-L: d -gal плюс COS (300 мг/кг/день) група лікування; COS-M: d -gal плюс COS (600 мг/кг) група лікування; COS-H: d -gal плюс COS (1200 мг/кг) група лікування.
3. Обговорення
Підводячи підсумок, VE, мономер якого часто використовується як позитивний контроль для досліджень підгострого старіння у мишей, індукованого d -gal, є добре відомим жиророзчинним вітаміном з чудовою антиоксидантною активністю [37,39,40 ]. Враховуючи, що VE не виявляв помітного стимулюючого ефекту на ці зниження показників імунної функції мишей, спричинених d -gal, було розумно зробити висновок, що певний захисний ефект VE на печінку та нирки у мишей, викликаних d -gal, може бути головним чином завдяки своїй антиокислювальній якості. Порівняно, COS, отриманий із раковин креветок і раків у океані, має різноманітні біологічні ефекти, такі як посилюючий ефект на ці d -gal-індуковане зниження показників імунної функції мишей та d -gal-викликаний знижується активність ключових антиоксидантних ферментів у мишах у печінці та нирках [12,15,16,17]. Щоб всебічно завершити наші результати, можна вважати, що COS мав гепатопротекторну та ренопротекторну дію на індуковані d -gal підгострі миші для старіння для реалізації її антивікової активності, яка може бути пов'язана з антиоксидантною здатністю COS, а також його хороша регулююча роль на імунну функцію мишей у більшій мірі.
4. Матеріали та методи
4.1. Матеріали та хімікати
COS (із хитозану шкаралупи креветок ферментативним гідролізом, середня молекулярна маса ≤1000 Да, ступінь деацетилювання ≥90%, ступінь полімеризації 3–7, розчинний у воді), майже білий порошок, придбаний у Beijing Zhong Tai He Technology (ZTH Tech, Пекін, Китай). Певну кількість COS зважували точно і розчиняли в ультрачистій воді кімнатної температури, щоб отримати три різні концентрації: 15, 30 і 60 мг/мл. d -gal (чистота ≥99%) та вітамін Е (VE, чистота 95%) були придбані у Sigma-Aldrich (Сент-Луїс, Міссурі, США). d -gal розчиняли в 0,9% фізіологічному розчині для ін'єкції підшкірно назад шиї мишам у дозі 250 мг/кг маси тіла, тоді як VE розчиняли в дистильованій воді, що містить 1% розчину Твін 80. Комерційно доступні набори для IgM, IgG, GSH-Px, SOD, CAT та концентрації білка, а також MDA були надані Інститутом біоінженерії Нанкін Цзяньчен (Нанкін, Китай). Усі інші хімічні речовини та реагенти, що використовувались у дослідженні, були аналітичного класу.
4.2. Тварини
Здорових семитижневих самців мишей KM вагою приблизно 30 г було придбано в Центрі лабораторних тваринних досліджень провінції Гуандун (сертифікований номер: SCXK (Yue) -2013-0002). Миші були розміщені в лабораторії тварин Університету океану Гуандун згідно з керівництвом з догляду та використання лабораторних тварин. Мишей утримували в клітках при температурі навколишнього середовища 23 ± 2 ° С з відносною вологістю 55 ± 10% при 12-годинному циклі автоматичного освітлення світло/темрява протягом експериментального періоду восьми тижнів. Вони могли отримати доступ до стандартної дієти на гранулах і пити воду за бажанням протягом усього періоду дослідження.
4.3. Підготовка моделі підгострого старіння мишей та лікування COS
Після адаптації протягом одного тижня мишей випадковим чином розподіляли на шість груп по вісім мишей, кожна згідно з Таблицею 3. Для того, щоб встановити природну модель старіння миші, d -gal (250 мг/кг/день) вводили підшкірно в задню частину шиї мишей один раз на день протягом 56 днів поспіль. Тоді як миші нормальної групи отримували однакові кількості фізіологічного розчину один раз на день замість d -gal. Після підшкірної ін’єкції d -gal мишам протягом однієї години мишей у нормальних та модельних групах обробляли дистильованою водою шляхом зонду (20 мл/кг/день); тим часом, мишей у групі VE лікували VE шляхом зонду (50 мг/кг/день) як позитивний контроль згідно з останніми звітами [37,39,40]. Мишей у групах COS-L, COS-M та COS-H обробляли зразками розчинів (три різні дози COS) на день шляхом елюювання відповідно, які вводили щодня, як показано в таблиці 3 .